Благодарим ви, че посетихте Nature.com.Използвате версия на браузър с ограничена поддръжка на CSS.За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer).Освен това, за да осигурим постоянна поддръжка, показваме сайта без стилове и JavaScript.
Показва въртележка от три слайда наведнъж.Използвайте бутоните Предишен и Следващ, за да преминете през три слайда наведнъж, или използвайте бутоните на плъзгача в края, за да преминете през три слайда наведнъж.
Беше разработен ултракомпактен (54 × 58 × 8,5 mm) и широкоапертурен (1 × 7 mm) деветцветен спектрометър, „разделен на две” от масив от десет дихроични огледала, който беше използван за мигновено спектрално изображение.Падащият светлинен поток с напречно сечение, по-малко от размера на апертурата, е разделен на непрекъсната лента с ширина 20 nm и девет цветни потока с централни дължини на вълната 530, 550, 570, 590, 610, 630, 650, 670 и 690 nm.Изображения от девет цветни потока се измерват едновременно ефективно от сензора за изображения.За разлика от конвенционалните решетки с дихроични огледала, разработената решетка с дихроични огледала има уникална конфигурация от две части, която не само увеличава броя на цветовете, които могат да бъдат измерени едновременно, но също така подобрява разделителната способност на изображението за всеки цветен поток.Разработеният деветцветен спектрометър се използва за четирикапилярна електрофореза.Едновременен количествен анализ на осем багрила, мигриращи едновременно във всяка капилярка, използвайки деветцветна лазерно индуцирана флуоресценция.Тъй като деветцветният спектрометър е не само ултрамалък и евтин, но също така има висок светлинен поток и достатъчна спектрална разделителна способност за повечето приложения за спектрални изображения, той може да се използва широко в различни области.
Хиперспектралните и мултиспектралните изображения се превърнаха във важна част от астрономията2, дистанционното наблюдение за наблюдение на Земята3,4, контрола на качеството на храната и водата5,6, опазването на изкуството и археологията7, съдебната медицина8, хирургията9, биомедицинския анализ и диагностиката10,11 и т.н. Поле 1 Незаменима технология ,12,13.Методите за измерване на спектъра на светлината, излъчвана от всяка точка на излъчване в зрителното поле, се разделят на (1) точково сканиране („метла“)14,15, (2) линейно сканиране („метла“)16,17,18 , (3) вълни за сканиране на дължина 19, 20, 21 и (4) изображения 22, 23, 24, 25.В случая на всички тези методи, пространствената разделителна способност, спектралната разделителна способност и времевата разделителна способност имат компромисна връзка9,10,12,26.В допълнение, светлинният поток оказва значително влияние върху чувствителността, т.е. съотношението сигнал/шум при спектрално изобразяване26.Светлинният поток, тоест ефективността на използване на светлината, е право пропорционална на съотношението на действително измереното количество светлина на всяка светлинна точка за единица време към общото количество светлина в измерения диапазон на дължината на вълната.Категория (4) е подходящ метод, когато интензитетът или спектърът на светлината, излъчвана от всяка точка на излъчване, се променя с времето или когато позицията на всяка точка на излъчване се променя с времето, тъй като спектърът на светлината, излъчвана от всички точки на излъчване, се измерва едновременно.24.
Повечето от горните методи се комбинират с големи, сложни и/или скъпи спектрометри, използващи 18 решетки или 14, 16, 22, 23 призми за класове (1), (2) и (4) или 20, 21 филтърни дискове, течни филтри .Кристални регулируеми филтри (LCTF)25 или акустооптични регулируеми филтри (AOTF)19 от категория (3).За разлика от тях многоогледалните спектрометри от категория (4) са малки и евтини поради тяхната проста конфигурация27,28,29,30.В допълнение, те имат висок светлинен поток, тъй като светлината, споделена от всяко дихроично огледало (т.е. предаваната и отразената светлина на падащата светлина върху всяко дихроично огледало) се използва напълно и непрекъснато.Въпреки това, броят на лентите с дължина на вълната (т.е. цветовете), които трябва да се измерват едновременно, е ограничен до около четири.
Спектралното изображение, базирано на флуоресцентно откриване, обикновено се използва за мултиплексен анализ в биомедицинското откриване и диагностика 10, 13.При мултиплексирането, тъй като множество аналити (напр. специфична ДНК или протеини) са белязани с различни флуоресцентни багрила, всеки аналит, присъстващ във всяка емисионна точка в зрителното поле, се определя количествено с помощта на многокомпонентен анализ.32 разгражда открития флуоресцентен спектър, излъчван от всяка емисионна точка.По време на този процес различни багрила, всяко излъчващо различна флуоресценция, могат да се локализират, тоест да съществуват съвместно в пространството и времето.В момента максималният брой багрила, които могат да бъдат възбудени от един лазерен лъч, е осем33.Тази горна граница не се определя от спектралната разделителна способност (т.е. броя на цветовете), а от ширината на флуоресцентния спектър (≥50 nm) и количеството на стоксовото изместване на багрилото (≤200 nm) при FRET (използвайки FRET)10 .Въпреки това, броят на цветовете трябва да бъде по-голям или равен на броя на багрилата, за да се елиминира спектралното припокриване на смесени багрила 31, 32.Следователно е необходимо да се увеличи броят на едновременно измерваните цветове до осем или повече.
Наскоро беше разработен ултракомпактен хептакроичен спектрометър (използващ набор от хептикроични огледала и сензор за изображение за измерване на четири флуоресцентни потока).Спектрометърът е с два до три порядъка по-малък от конвенционалните спектрометри, използващи решетки или призми34,35.Въпреки това е трудно да се поставят повече от седем дихроични огледала в спектрометър и едновременно да се измерват повече от седем цвята36,37.С увеличаване на броя на дихроичните огледала се увеличава максималната разлика в дължините на оптичните пътища на дихроичните светлинни потоци и става трудно да се покажат всички светлинни потоци в една сензорна равнина.Най-дългият оптичен път на светлинния поток също се увеличава, така че ширината на апертурата на спектрометъра (т.е. максималната ширина на светлината, анализирана от спектрометъра) намалява.
В отговор на горните проблеми беше разработен ултракомпактен деветцветен спектрометър с двуслойна „дихроична“ дехроматична огледална решетка и сензор за изображения за мигновено спектрално изображение [категория (4)].В сравнение с предишните спектрометри, разработеният спектрометър има по-малка разлика в максималната дължина на оптичния път и по-малка максимална дължина на оптичния път.Той е приложен към четирикапилярна електрофореза за откриване на лазерно индуцирана деветцветна флуоресценция и за количествено определяне на едновременната миграция на осем багрила във всяка капилярка.Тъй като разработеният спектрометър е не само ултрамалък и евтин, но също така има висок светлинен поток и достатъчна спектрална разделителна способност за повечето приложения за спектрални изображения, той може да се използва широко в различни области.
Традиционният деветцветен спектрометър е показан на фиг.1а.Дизайнът му следва този на предишния ултрамалък седемцветен спектрометър 31. Състои се от девет дихроични огледала, разположени хоризонтално под ъгъл от 45° надясно, а сензорът за изображение (S) е разположен над деветте дихроични огледала.Светлината, навлизаща отдолу (C0), се разделя от масив от девет дихроични огледала на девет светлинни потока, вървящи нагоре (C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 и C9).Всичките девет цветни потока се подават директно към сензора за изображения и се откриват едновременно.В това изследване C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 и C9 са подредени по дължина на вълната и са представени от магента, виолетово, синьо, циан, зелено, жълто, оранжево, червено-оранжево и червено, съответно.Въпреки че тези обозначения на цветовете се използват в този документ, както е показано на фигура 3, защото се различават от действителните цветове, виждани от човешкото око.
Принципни диаграми на конвенционални и нови деветцветни спектрометри.(a) Конвенционален деветцветен спектрометър с набор от девет дихроични огледала.( b ) Нов деветцветен спектрометър с двуслоен дихроичен огледален масив.Падащият светлинен поток C0 се разделя на девет цветни светлинни потока C1-C9 и се открива от сензора за изображения S.
Разработеният нов деветцветен спектрометър има двуслойна дихроична огледална решетка и сензор за изображение, както е показано на Фиг. 1b.В долния слой пет дихроични огледала са наклонени на 45° надясно, подравнени вдясно от центъра на масива от декамери.На най-горното ниво пет допълнителни дихроични огледала са наклонени на 45° наляво и разположени от центъра наляво.Най-лявото дихроично огледало на долния слой и най-дясното дихроично огледало на горния слой се припокриват.Падащият светлинен поток (C0) е разделен отдолу на четири изходящи хроматични потоци (C1-C4) от пет дихроични огледала отдясно и пет изходящи хроматични потоци (C5-C4) от пет дихроични огледала отляво C9).Подобно на конвенционалните деветцветни спектрометри, всичките девет цветни потока се инжектират директно в сензора за изображения (S) и се откриват едновременно.Сравнявайки фигури 1а и 1b, може да се види, че в случая на новия деветцветен спектрометър както максималната разлика, така и най-дългата оптична дължина на пътя на деветте цветни потока са намалени наполовина.
Подробната конструкция на ултрамалка двуслойна решетка от дихроични огледала 29 mm (ширина) × 31 mm (дълбочина) × 6 mm (височина) е показана на Фигура 2. Решетката от десетични дихроични огледала се състои от пет дихроични огледала отдясно (M1-M5) и пет дихроични огледала отляво (M6-M9 и друго M5), всяко дихроично огледало е фиксирано в горната алуминиева скоба.Всички дихроични огледала са разместени, за да компенсират паралелното изместване поради пречупване на потока през огледалата.Под M1 е фиксиран лентов филтър (BP).Размерите на M1 и BP са 10 mm (дълга страна) x 1,9 mm (къса страна) x 0,5 mm (дебелина).Размерите на останалите дихроични огледала са 15 mm × 1, 9 mm × 0, 5 mm.Стъпката на матрицата между M1 и M2 е 1,7 mm, докато стъпката на матрицата на други дихроични огледала е 1,6 mm.На фиг.2c комбинира падащия светлинен поток C0 и девет цветни светлинни потока C1-C9, разделени от декамерна матрица от огледала.
Изграждане на двуслойна дихроична огледална матрица.( a ) Изглед в перспектива и ( b ) изглед на напречно сечение на двуслоен дихроичен огледален масив (размери 29 mm x 31 mm x 6 mm).Състои се от пет дихроични огледала (M1-M5), разположени в долния слой, пет дихроични огледала (M6-M9 и друго M5), разположени в горния слой, и лентов филтър (BP), разположен под M1.( c ) Изглед на напречно сечение във вертикална посока, с припокриване на C0 и C1-C9.
Широчината на отвора в хоризонтална посока, обозначена с ширината C0 на фиг. 2, c, е 1 mm, а в посока, перпендикулярна на равнината на фиг. 2, c, зададена от конструкцията на алуминиевата скоба, – 7 мм.Това означава, че новият деветцветен спектрометър има голям размер на апертурата от 1 mm × 7 mm.Оптичният път на C4 е най-дългият сред C1-C9, а оптичният път на C4 вътре в дихроичния огледален масив, поради горния ултрамалък размер (29 mm × 31 mm × 6 mm), е 12 mm.В същото време дължината на оптичния път на C5 е най-късата сред C1-C9, а дължината на оптичния път на C5 е 5,7 mm.Следователно максималната разлика в дължината на оптичния път е 6,3 mm.Горните дължини на оптичния път са коригирани за дължината на оптичния път за оптично предаване на M1-M9 и BP (от кварц).
Спектралните свойства на М1−М9 и VR са изчислени така, че потоците С1, С2, С3, С4, С5, С6, С7, С8 и С9 да са във вълновия диапазон 520–540, 540–560, 560–580, 580 –600, 600–620, 620–640, 640–660, 660–680 и 680–700 nm, съответно.
Снимка на произведената матрица от декахроматични огледала е показана на фиг. 3а.M1-M9 и BP са залепени съответно към 45-градусовия наклон и хоризонталната равнина на алуминиевата опора, докато M1 и BP са скрити на гърба на фигурата.
Производство на масив от деканови огледала и неговата демонстрация.(a) Ред от произведени дехроматични огледала.( b ) Деветцветно разделено изображение с размери 1 mm × 7 mm, проектирано върху лист хартия, поставен пред редица дехроматични огледала и осветен с бяла светлина.(c) Ред от декохроматични огледала, осветени с бяла светлина отзад.(d) Разделящ се поток от девет цвята, излъчван от огледалния масив на декан, наблюдаван чрез поставяне на пълна с дим акрилна кутия пред огледалния масив на декан в c и затъмняване на стаята.
Измерените спектри на предаване на M1-M9 C0 при ъгъл на падане 45° и измереният спектър на предаване на BP C0 при ъгъл на падане 0° са показани на Фиг.4а.Спектрите на предаване на C1-C9 спрямо C0 са показани на фиг.4б.Тези спектри са изчислени от спектрите на фиг.4а в съответствие с оптичния път С1-С9 на Фиг. 4а.1б и 2в.Например TS(C4) = TS (BP) × [1 − TS (M1)] × TS (M2) × TS (M3) × TS (M4) × [1 − TS (M5)], TS(C9 ) = TS (BP) × TS (M1) × [1 − TS (M6)] × TS (M7) × TS (M8) × TS (M9) × [1 − TS (M5)], където TS(X) и [ 1 − TS(X)] са спектрите на пропускане и отражение на X, съответно.Както е показано на фигура 4b, честотните ленти (широчина на честотната лента ≥50%) на C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 и C9 са 521-540, 541-562, 563-580, 581-602, 603 -623, 624-641, 642-657, 659-680 и 682-699 nm.Тези резултати са в съответствие с разработените диапазони.В допълнение, ефективността на използване на светлината C0 е висока, тоест средната максимална пропускливост на светлина C1-C9 е 92%.
Спектри на предаване на дихроично огледало и разделен деветцветен поток.( а ) Измерени спектри на предаване на M1-M9 при 45 ° падане и BP при 0 ° падане.( b ) Спектри на предаване на C1–C9 спрямо C0, изчислени от ( a ).
На фиг.3с, масивът от дихроични огледала е разположен вертикално, така че дясната му страна на Фиг. 3а е горната страна и белият лъч на колимирания светодиод (C0) е осветен отзад.Масивът от дехроматични огледала, показан на фигура 3а, е монтиран в адаптер с размери 54 mm (височина) × 58 mm (дълбочина) × 8,5 mm (дебелина).На фиг.3d, в допълнение към състоянието, показано на фиг.3c, пълен с дим акрилен резервоар беше поставен пред редица декохроматични огледала, като светлините в стаята бяха изключени.В резултат на това в резервоара се виждат девет дихроични потока, излъчвани от редица декатроични огледала.Всеки разделен поток има правоъгълно напречно сечение с размери 1 × 7 mm, което съответства на размера на апертурата на новия деветцветен спектрометър.На Фигура 3b лист хартия е поставен пред масива от дихроични огледала на Фигура 3c и изображение 1 x 7 mm на девет дихроични потока, проектирани върху хартията, се наблюдава от посоката на движение на хартията.потоци.Деветте потока за разделяне на цветовете на фиг.3b и d са C4, C3, C2, C1, C5, C6, C7, C8 и C9 отгоре надолу, което също може да се види на фигури 1 и 2. 1b и 2c.Те се наблюдават в цветове, съответстващи на техните дължини на вълните.Поради ниския интензитет на бялата светлина на светодиода (вижте допълнителна фигура S3) и чувствителността на цветната камера, използвана за улавяне на C9 (682–699 nm) на фиг. Други потоци на разделяне са слаби.По същия начин C9 беше слабо видим с просто око.Междувременно C2 (вторият поток отгоре) изглежда зелен на фигура 3, но изглежда по-жълт с просто око.
Преходът от фигура 3c към d е показан в допълнително видео 1. Веднага след като бялата светлина от светодиода премине през дехроматичния огледален масив, тя се разделя едновременно на девет цветни потока.Накрая димът във ваната постепенно се разсея отгоре надолу, така че деветте цветни праха също изчезнаха отгоре надолу.За разлика от това, в Допълнително видео 2, когато дължината на вълната на светлинния поток, падащ върху масива от дехроматични огледала, беше променена от дълга на къса в порядъка на 690, 671, 650, 632, 610, 589, 568, 550 и 532 nm ., Показват се само съответните разделени потоци от деветте разделени потоци в реда на C9, C8, C7, C6, C5, C4, C3, C2 и C1.Акрилният резервоар е заменен от кварцов басейн и люспите на всеки преместен поток могат ясно да се наблюдават от наклонената посока нагоре.В допълнение, подвидеото 3 се редактира така, че частта за промяна на дължината на вълната на подвидео 2 се възпроизвежда отново.Това е най-красноречивият израз на характеристиките на декохроматичен набор от огледала.
Горните резултати показват, че произведеният дехроматичен огледален масив или новият деветцветен спектрометър работи по предназначение.Новият деветцветен спектрометър се формира чрез монтиране на масив от дехроматични огледала с адаптери директно върху платката на сензора за изображение.
Светлинен поток с дължина на вълната от 400 до 750 nm, излъчван от четири точки на излъчване φ50 μm, разположени на интервали от 1 mm в посока, перпендикулярна на равнината на Фиг. 2c, съответно Изследвания 31, 34. Решетката от четири лещи се състои от четири лещи φ1 mm с фокусно разстояние 1,4 mm и стъпка 1 mm.Четири колимирани потока (четири C0) попадат върху DP на нов деветцветен спектрометър, разположени на интервали от 1 mm.Редица от дихроични огледала разделя всеки поток (C0) на девет цветни потока (C1-C9).Получените 36 потока (четири комплекта от C1-C9) след това се инжектират директно в CMOS (S) сензор за изображения, директно свързан към масив от дихроични огледала.В резултат на това, както е показано на Фиг. 5а, поради малката максимална разлика в оптичния път и късия максимален оптичен път, изображенията на всичките 36 потока бяха открити едновременно и ясно с еднакъв размер.Според спектрите надолу по веригата (вижте допълнителна фигура S4), интензитетът на изображението на четирите групи C1, C2 и C3 е относително нисък.Тридесет и шест изображения бяха с размер 0, 57 ± 0, 05 mm (средно ± SD).Така увеличението на изображението е средно 11,4.Вертикалното разстояние между изображенията е средно 1 mm (същото разстояние като решетка от лещи), а хоризонталното разстояние е средно 1,6 mm (същото разстояние като решетка дихроично огледало).Тъй като размерът на изображението е много по-малък от разстоянието между изображенията, всяко изображение може да бъде измерено независимо (с нисък преход).Междувременно, изображения на двадесет и осем потока, записани от конвенционалния седемцветен спектрометър, използван в нашето предишно изследване, са показани на Фиг. 5 B. Масивът от седем дикроични огледала беше създаден чрез премахване на двете най-десни дикроични огледала от масива от девет дикроични огледала огледала на фигура 1а.Не всички изображения са ясни, размерът на изображението се увеличава от C1 до C7.Двадесет и осем изображения са с размер 0,70 ± 0,19 mm.Поради това е трудно да се поддържа висока разделителна способност на всички изображения.Коефициентът на вариация (CV) за размер на изображение 28 на Фигура 5b е 28%, докато CV за размер на изображение 36 на Фигура 5a намалява до 9%.Горните резултати показват, че новият деветцветен спектрометър не само увеличава броя на едновременно измерените цветове от седем на девет, но също така има висока резолюция на изображението за всеки цвят.
Сравнение на качеството на разделеното изображение, формирано от конвенционални и нови спектрометри.( а ) Четири групи от деветцветни разделени изображения (C1-C9), генерирани от новия деветцветен спектрометър.( b ) Четири набора от седемцветни разделени изображения (C1-C7), формирани с конвенционален седемцветен спектрометър.Потоците (C0) с дължини на вълните от 400 до 750 nm от четири емисионни точки се колимират и попадат съответно на всеки спектрометър.
Спектралните характеристики на деветцветния спектрометър бяха оценени експериментално и резултатите от оценката са показани на Фигура 6. Обърнете внимание, че Фигура 6а показва същите резултати като Фигура 5а, т.е. (4 групи C1–C9).Напротив, както е показано на фиг. 6b–j, когато всеки C0 има специфична дължина на вълната от 530, 550, 570, 590, 610, 630, 650, 670 или 690 nm, има почти само четири съответстващи изображения (четири открити групи C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 или C9).Въпреки това, някои от изображенията, съседни на четирите съответни изображения, са много слабо открити, тъй като спектрите на предаване C1–C9, показани на Фиг. 4b, се припокриват леко и всеки C0 има лента от 10 nm при специфична дължина на вълната, както е описано в метода.Тези резултати са в съответствие със спектрите на предаване на C1-C9, показани на фиг.4b и допълнителни видеоклипове 2 и 3. С други думи, девет цветният спектрометър работи според очакванията въз основа на резултатите, показани на фиг.4б.Следователно се заключава, че разпределението на интензитета на изображението C1-C9 е спектърът на всеки C0.
Спектрални характеристики на деветцветен спектрометър.Новият деветцветен спектрометър генерира четири комплекта от деветцветни разделени изображения (C1-C9), когато падащата светлина (четири C0) има дължина на вълната (a) 400-750 nm (както е показано на Фигура 5a), (b) 530 nm.nm, (c) 550 nm, (d) 570 nm, (e) 590 nm, (f) 610 nm, (g) 630 nm, (h) 650 nm, (i) 670 nm, (j) 690 nm, съответно.
Разработеният деветцветен спектрометър беше използван за четирикапилярна електрофореза (за подробности вижте Допълнителни материали) 31, 34, 35.Матрицата с четири капиляра се състои от четири капиляра (външен диаметър 360 μm и вътрешен диаметър 50 μm), разположени на интервали от 1 mm на мястото на лазерно облъчване.Проби, съдържащи ДНК фрагменти, белязани с 8 багрила, а именно FL-6C (багрило 1), JOE-6C (багрило 2), dR6G (багрило 3), TMR-6C (багрило 4), CXR-6C (багрило 5), TOM- 6C (багрило 6), LIZ (багрило 7) и WEN (багрило 8) във възходящ ред на флуоресцентна дължина на вълната, разделени във всяка от четирите капиляри (наричани по-долу Cap1, Cap2, Cap3 и Cap4).Лазерно индуцираната флуоресценция от Cap1-Cap4 беше колимирана с масив от четири лещи и едновременно записана с деветцветен спектрометър.Динамиката на интензитета на деветцветна (C1-C9) флуоресценция по време на електрофореза, т.е. деветцветна електрофореграма на всяка капилярка, е показана на фиг. 7а.В Cap1-Cap4 се получава еквивалентна деветцветна електрофореграма.Както е посочено от стрелките Cap1 на Фигура 7а, осемте пика на всяка деветцветна електрофореграма показват съответно една флуоресцентна емисия от Dye1-Dye8.
Едновременно количествено определяне на осем багрила с помощта на деветцветен четирикапилярен спектрометър за електрофореза.( а ) Деветцветна (C1-C9) електрофореграма на всяка капилярка.Осемте пика, обозначени със стрелки Cap1, показват отделни флуоресцентни емисии на осем багрила (Dye1-Dye8).Цветовете на стрелките съответстват на цветовете (b) и (c).( b ) Флуоресцентни спектри на осем багрила (Dye1-Dye8) на капиляр.c Електроферограми на осем багрила (Dye1-Dye8) на капиляр.Пиковете на маркирани с Dye7 ДНК фрагменти са обозначени със стрелки и техните базови дължини на Cap4 са посочени.
Разпределенията на интензитета на C1–C9 на осем пика са показани на фиг.7б, съответно.Тъй като и C1-C9, и Dye1-Dye8 са в ред на дължината на вълната, осемте разпределения на Фиг. 7b показват флуоресцентните спектри на Dye1-Dye8 последователно отляво надясно.В това проучване Dye1, Dye2, Dye3, Dye4, Dye5, Dye6, Dye7 и Dye8 се появяват съответно в магента, виолетово, синьо, циан, зелено, жълто, оранжево и червено.Обърнете внимание, че цветовете на стрелките на Фиг. 7a съответстват на цветовете на багрилото на Фиг. 7b.Интензитетите на C1-C9 флуоресценция за всеки спектър на Фигура 7b бяха нормализирани, така че тяхната сума да е равна на единица.Осем еквивалентни флуоресцентни спектъра бяха получени от Cap1-Cap4.Може ясно да се наблюдава спектралното припокриване на флуоресценцията между багрило 1-багрило 8.
Както е показано на Фигура 7с, за всяка капилярка, деветцветната електрофореграма на Фигура 7а беше преобразувана в електроферограма с осем багрила чрез многокомпонентен анализ въз основа на осемте флуоресцентни спектъра на Фигура 7b (вижте Допълнителни материали за подробности).Тъй като спектралното припокриване на флуоресценцията на Фигура 7а не е показано на Фигура 7с, Dye1-Dye8 може да бъде идентифициран и количествено определен поотделно във всяка времева точка, дори ако различни количества от Dye1-Dye8 флуоресцират едновременно.Това не може да се направи с традиционното разпознаване на седем цвята31, но може да се постигне с разработеното разпознаване на девет цвята.Както е показано от стрелките Cap1 на фиг. 7c, само флуоресцентните емисионни синглети Dye3 (синьо), Dye8 (червено), Dye5 (зелено), Dye4 (циан), Dye2 (лилаво), Dye1 (пурпурно) и Dye6 (жълто) ) се наблюдават в очаквания хронологичен ред.За флуоресцентната емисия на багрило 7 (оранжево), в допълнение към единичния пик, посочен с оранжевата стрелка, бяха наблюдавани няколко други единични пика.Този резултат се дължи на факта, че пробите съдържат стандарти за размер, маркирани с Dye7 ДНК фрагменти с различни базови дължини.Както е показано на фигура 7c, за Cap4 тези дължини на основата са 20, 40, 60, 80, 100, 114, 120, 140, 160, 180, 200, 214 и 220 дължини на основата.
Основните характеристики на деветцветния спектрометър, разработен с помощта на матрица от двуслойни дихроични огледала, са малки размери и прост дизайн.Тъй като масивът от дехроматични огледала вътре в адаптера, показан на фиг.3c, монтиран директно върху платката на сензора за изображение (вижте Фиг. S1 и S2), деветцветният спектрометър има същите размери като адаптера, т.е. 54 × 58 × 8,5 mm.(дебелина).Този свръхмалък размер е с два до три порядъка по-малък от конвенционалните спектрометри, които използват решетки или призми.В допълнение, тъй като деветцветният спектрометър е конфигуриран така, че светлината да пада перпендикулярно на повърхността на сензора за изображения, пространството може лесно да бъде разпределено за деветцветния спектрометър в системи като микроскопи, поточни цитометри или анализатори.Анализатор за електрофореза с капилярна решетка за още по-голяма миниатюризация на системата.В същото време размерът на десет дихроични огледала и лентови филтри, използвани в деветцветния спектрометър, е само 10 × 1,9 × 0,5 mm или 15 × 1,9 × 0,5 mm.По този начин, повече от 100 такива малки дихроични огледала и лентови филтри, съответно, могат да бъдат изрязани от дихроично огледало и 60 mm2 лентов филтър, съответно.Следователно, набор от дехроматични огледала може да бъде произведен на ниска цена.
Друга особеност на деветцветния спектрометър са неговите отлични спектрални характеристики.По-специално, той позволява получаването на спектрални изображения на моментни снимки, т.е. едновременното получаване на изображения със спектрална информация.За всяко изображение беше получен непрекъснат спектър с диапазон на дължина на вълната от 520 до 700 nm и разделителна способност от 20 nm.С други думи, за всяко изображение се откриват девет цветни интензитета на светлината, т.е. девет ленти от 20 nm, разделящи поравно обхвата на дължината на вълната от 520 до 700 nm.Чрез промяна на спектралните характеристики на дихроичното огледало и лентовия филтър, обхватът на дължината на вълната на деветте ленти и ширината на всяка лента могат да бъдат регулирани.Откриването на девет цвята може да се използва не само за флуоресцентни измервания със спектрални изображения (както е описано в този доклад), но и за много други общи приложения, използващи спектрални изображения.Въпреки че хиперспектралното изображение може да открие стотици цветове, беше установено, че дори при значително намаляване на броя на откриваемите цветове, множество обекти в зрителното поле могат да бъдат идентифицирани с достатъчна точност за много приложения38,39,40.Тъй като пространствената разделителна способност, спектралната разделителна способност и времевата разделителна способност имат компромис в спектралното изображение, намаляването на броя на цветовете може да подобри пространствената разделителна способност и времевата разделителна способност.Той може също да използва прости спектрометри като този, разработен в това изследване, и допълнително да намали обема на изчисленията.
В това изследване осем багрила бяха количествено определени едновременно чрез спектрално разделяне на техните припокриващи се флуоресцентни спектри въз основа на откриването на девет цвята.До девет багрила могат да бъдат количествено определени едновременно, съжителстващи във времето и пространството.Специално предимство на деветцветния спектрометър е неговият висок светлинен поток и голяма апертура (1 × 7 mm).Декановата огледална решетка има максимално пропускане на 92% от светлината от блендата във всеки от деветте диапазона на дължина на вълната.Ефективността на използването на падаща светлина в диапазона на дължината на вълната от 520 до 700 nm е почти 100%.В такъв широк диапазон от дължини на вълните никоя дифракционна решетка не може да осигури толкова висока ефективност на използване.Дори ако ефективността на дифракция на дифракционна решетка надвишава 90% при определена дължина на вълната, тъй като разликата между тази дължина на вълната и определена дължина на вълната се увеличава, ефективността на дифракция при друга дължина на вълната намалява41.Ширината на отвора, перпендикулярна на посоката на равнината на фиг. 2c, може да бъде разширена от 7 mm до ширината на сензора за изображение, като например в случая на сензора за изображение, използван в това изследване, чрез леко модифициране на декамерния масив.
Деветцветният спектрометър може да се използва не само за капилярна електрофореза, както е показано в това изследване, но и за различни други цели.Например, както е показано на фигурата по-долу, деветцветен спектрометър може да се приложи към флуоресцентен микроскоп.Равнината на пробата се показва на сензора за изображения на деветцветния спектрометър през 10x обектив.Оптичното разстояние между лещата на обектива и сензора за изображения е 200 mm, докато оптичното разстояние между падащата повърхност на деветцветния спектрометър и сензора за изображения е само 12 mm.Следователно изображението беше изрязано до приблизително размера на отвора (1 × 7 mm) в равнината на падане и разделено на девет цветни изображения.Това означава, че спектрално изображение на деветцветна моментна снимка може да бъде направено върху площ от 0,1 × 0,7 mm в равнината на пробата.Освен това е възможно да се получи деветцветно спектрално изображение на по-голяма площ върху равнината на пробата чрез сканиране на пробата спрямо обектива в хоризонтална посока на фиг. 2c.
Компонентите на дехроматичната огледална решетка, а именно M1-M9 и BP, са направени по поръчка от Asahi Spectra Co., Ltd., използвайки стандартни методи за утаяване.Многослойни диелектрични материали бяха нанесени индивидуално върху десет кварцови пластини с размери 60 × 60 mm и дебелина 0,5 mm, отговарящи на следните изисквания: M1: IA = 45 °, R ≥ 90% при 520–590 nm, Tave ≥ 90% при 610– 610 nm.700 nm, M2: IA = 45°, R ≥ 90% при 520–530 nm, Tave ≥ 90% при 550–600 nm, M3: IA = 45°, R ≥ 90% при 540–550 nm, Tave ≥ 90 % при 570–600 nm, M4: IA = 45°, R ≥ 90% при 560–570 nm, Tave ≥ 90% при 590–600 nm, M5: IA = 45°, R ≥ 98% при 580–600 nm , R ≥ 98% при 680–700 nm, M6: IA = 45°, Tave ≥ 90% при 600–610 nm, R ≥ 90% при 630–700 nm, M7: IA = 45°, R ≥ 90% при 620–630 nm, Taw ≥ 90% при 650–700 nm, M8: IA = 45°, R ≥ 90% при 640–650 nm, Taw ≥ 90% при 670–700 nm, M9: IA = 45°, R ≥ 90% при 650-670 nm, Tave ≥ 90% при 690-700 nm, BP: IA = 0°, T ≤ 0,01% при 505 nm, Tave ≥ 95% при 530-690 nm при 530 nm T ≥ 90% при -690 nm и T ≤ 1% при 725-750 nm, където IA, T, Tave и R са ъгълът на падане, коефициентът на пропускане, средният коефициент на пропускане и коефициентът на отразяване на неполяризирана светлина.
Бялата светлина (C0) с диапазон на дължина на вълната от 400–750 nm, излъчвана от LED източник на светлина (AS 3000, AS ONE CORPORATION), беше колимирана и падаше вертикално върху DP на масив от дихроични огледала.Спектърът на бялата светлина на светодиодите е показан на допълнителна фигура S3.Поставете акрилен резервоар (размери 150 × 150 × 30 mm) директно пред огледалната матрица на декамера, срещу PSU.Димът, генериран при потапянето на сух лед във вода, след това се излива в акрилен резервоар, за да се наблюдават деветцветните разделени потоци C1-C9, излъчвани от масива от декахроматични огледала.
Алтернативно, колимираната бяла светлина (C0) преминава през филтър преди да влезе в DP.Първоначално филтрите са били филтри с неутрална плътност с оптична плътност 0,6.След това използвайте моторизиран филтър (FW212C, FW212C, Thorlabs).Накрая включете отново ND филтъра.Ширините на честотната лента на деветте лентови филтъра съответстват съответно на C9, C8, C7, C6, C5, C4, C3, C2 и C1.Кварцова клетка с вътрешни размери 40 (оптична дължина) x 42,5 (височина) x 10 mm (ширина) беше поставена пред набор от декохроматични огледала, срещу BP.След това димът се подава през тръба в кварцовата клетка, за да се поддържа концентрацията на дим в кварцовата клетка, за да се визуализират деветцветните разделени потоци C1-C9, излъчвани от дехроматичния огледален масив.
Видеоклип на деветцветния разделен светлинен поток, излъчван от редица деканови огледала, беше заснет в режим на изтичане на времето на iPhone XS.Заснемайте изображения на сцената при 1 кадър в секунда и компилирайте изображенията, за да създадете видео при 30 кадъра в секунда (за опционално видео 1) или 24 кадъра в секунда (за опционални видео 2 и 3).
Поставете плоча от неръждаема стомана с дебелина 50 µm (с четири отвора с диаметър 50 µm на интервали от 1 mm) върху дифузионната плоча.Светлина с дължина на вълната 400-750 nm се облъчва върху дифузьорната плоча, получена чрез преминаване на светлина от халогенна лампа през къс пропускащ филтър с дължина на вълната на прекъсване 700 nm.Светлинният спектър е показан на допълнителна фигура S4.Алтернативно, светлината също преминава през един от 10 nm лентови филтри, центрирани на 530, 550, 570, 590, 610, 630, 650, 670 и 690 nm, и удря плочата на дифузора.В резултат на това се образуват четири радиационни точки с диаметър φ50 μm и различни дължини на вълната върху плоча от неръждаема стомана срещу плочата на дифузора.
Решетка от четири капиляра с четири лещи е монтирана на деветцветен спектрометър, както е показано на фигури 1 и 2. C1 и C2.Четирите капиляра и четирите лещи бяха същите като в предишни проучвания 31, 34.Лазерен лъч с дължина на вълната 505 nm и мощност 15 mW се облъчва едновременно и равномерно отстрани към емисионните точки на четири капиляра.Флуоресценцията, излъчвана от всяка емисионна точка, се колимира от съответната леща и се разделя на девет цветни потока от набор от дехроматични огледала.След това получените 36 потока бяха директно инжектирани в CMOS сензор за изображения (C11440–52U, Hamamatsu Photonics K·K.) и техните изображения бяха записани едновременно.
ABI PRISM® BigDye® Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems), 4 µl GeneScan™ 600 LIZ™ багрило се смесва за всяка капилярка чрез смесване на 1 µl PowerPlex® 6C Matrix Standard (Promega Corporation), 1 µl стандарт за размер на сместа.v2.0 (Thermo Fisher Scientific) и 14 µl вода.Матричният стандарт PowerPlex® 6C се състои от шест ДНК фрагмента, маркирани с шест багрила: FL-6C, JOE-6C, TMR-6C, CXR-6C, TOM-6C и WEN, по реда на максималната дължина на вълната.Основните дължини на тези ДНК фрагменти не са разкрити, но последователността на базовата дължина на ДНК фрагменти, маркирани с WEN, CXR-6C, TMR-6C, JOE-6C, FL-6C и TOM-6C, е известна.Сместа в ABI PRISM® BigDye® Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kit съдържа ДНК фрагмент, белязан с dR6G багрило.Дължините на базите на ДНК фрагментите също не се разкриват.GeneScan™ 600 LIZ™ Dye Size Standard v2.0 включва 36 маркирани с LIZ ДНК фрагмента.Базовите дължини на тези ДНК фрагменти са 20, 40, 60, 80, 100, 114, 120, 140, 160, 180, 200, 214, 220, 240, 250, 260, 280, 300, 314, 320, 340, 360, 380, 400, 414, 420, 440, 460, 480, 500, 514, 520, 540, 560, 580 и 600 основа.Пробите се денатурират при 94°С за 3 минути, след което се охлаждат върху лед за 5 минути.Пробите се инжектират във всяка капилярка при 26 V/cm за 9 s и се разделят във всяка капилярка, пълна с полимерен разтвор POP-7™ (Thermo Fisher Scientific) с ефективна дължина 36 cm и напрежение 181 V/cm и ъгъл от 60°.ОТ.
Всички данни, получени или анализирани в хода на това проучване, са включени в тази публикувана статия и нейната допълнителна информация.Други данни, свързани с това проучване, са достъпни от съответните автори при разумно искане.
Khan, MJ, Khan, HS, Yousaf, A., Khurshid, K. и Abbas, A. Текущи тенденции в анализа на хиперспектрални изображения: преглед.Достъп до IEEE 6, 14118–14129.https://doi.org/10.1109/ACCESS.2018.2812999 (2018).
Vaughan, AH Астрономическа интерферометрична спектроскопия на Фабри-Перо.Инсталирай.Преподобни Астрон.астрофизика.5, 139-167.https://doi.org/10.1146/annurev.aa.05.090167.001035 (1967).
Goetz, AFH, Wein, G., Solomon, JE и Rock, BN Спектроскопия на изображения от дистанционно наблюдение на Земята.Наука 228, 1147–1153.https://doi.org/10.1126/science.228.4704.1147 (1985).
Yokoya, N., Grohnfeldt, C. и Chanussot, J. Сливане на хиперспектрални и мултиспектрални данни: сравнителен преглед на скорошни публикации.IEEE Науки за Земята.Журнал за дистанционно наблюдение.5:29–56.https://doi.org/10.1109/MGRS.2016.2637824 (2017).
Gowen, AA, O'Donnell, SP, Cullen, PJ, Downey, G. и Frias, JM Хиперспектралното изображение е нов аналитичен инструмент за контрол на качеството и безопасността на храните.Тенденции в хранителната наука.технология.18, 590-598.https://doi.org/10.1016/j.tifs.2007.06.001 (2007).
ElMasri, G., Mandour, N., Al-Rejaye, S., Belin, E. и Rousseau, D. Последни приложения на мултиспектрални изображения за наблюдение на фенотипа и качеството на семената – преглед.Сензори 19, 1090 (2019).
Liang, H. Напредък в мултиспектралните и хиперспектрални изображения за археология и опазване на изкуството.Кандидатствайте за физически 106, 309–323.https://doi.org/10.1007/s00339-011-6689-1 (2012).
Edelman GJ, Gaston E., van Leeuwen TG, Cullen PJ и Alders MKG Хиперспектрално изображение за безконтактен анализ на криминалистични следи.Криминалистика.вътрешни 223, 28-39.https://doi.org/10.1016/j.forsciint.2012.09.012 (2012).
Време на публикуване: 10 януари 2023 г